Biologia Molecular

dogma central e exceções · replicação semiconservativa (Meselson–Stahl) · forquilha e enzimas · fidelidade e telômeros · vias de reparo (BER · NER · MMR · HR · NHEJ · translesão) · síndromes genéticas · letalidade sintética BRCA–PARP

1. Dogma central: a regra e as exceções que a prova cobra

O dogma central (Crick, 1958) define o fluxo da informação: DNA → RNA → proteína — replicação (DNA→DNA), transcrição (DNA→RNA) e tradução (RNA→proteína). As exceções canônicas: retrotranscrição (retrovírus como o HIV copiam RNA para DNA com a transcriptase reversa), a telomerase (usa RNA próprio como molde para estender DNA) e vírus de RNA que replicam RNA (ex.: poliovírus). A transcriptase reversa é a base laboratorial da RT-PCR e a alvo de antirretrovirais — o dogma na prova serve para perguntar exatamente onde cada fármaco e cada teste entram no fluxo.

2. A forquilha de replicação: quem faz o quê

A replicação é bidirecional a partir de origens (ORC nos eucariotos), semicontínua: a fita líder é sintetizada de forma contínua; a fita atrasada, de forma descontínua, em fragmentos de Okazaki (~100–200 nt nos eucariotos; 1.000–2.000 nt em bactérias), depois removidos os primers e selados os nicks pela ligase. Todas as polimerases sintetizam exclusivamente 5'→3' e exigem primer.

3. Telômeros: o relógio de divisões

O extremo 5' da fita atrasada não pode ser replicado (problema do end-replication) — os telômeros (repetições TTAGGG) encurtam 50–200 pb por divisão, limitando as divisões somáticas (limite de Hayflick, ~40–60 divisões). A telomerase (TERT + RNA molde TERC), uma transcriptase reversa, compensa o encurtamento em células germinativas, tronco e ~85–90% dos cânceres — por isso é alvo terapêutico em estudo. Mutação nos componentes da telomerase causa disqueratose congênita (falha medular, displasia ungueal, leucoplasia) — o elo encurtamento telomérico ↔ doença clínica.

4. Reparo do DNA: a tabela que decide a questão

5. Aplicação clínica: quando o reparo falha, o câncer e a terapia aparecem

Xerodermo pigmentoso: defeito do NER → risco de câncer de pele até 10.000× maior antes dos 20 anos sob exposição UV. Síndrome de Lynch: defeito do MMR (MLH1, MSH2, MSH6, PMS2) → risco de câncer colorretal de 40–80% ao longo da vida e de endometrial de até ~60% nas portadoras — o rastreio e a cirurgia profilática mudam de conduta. BRCA1/2 (HR): risco de câncer de mama de ~72% (BRCA1) e ~69% (BRCA2) até os 80 anos e de ovário de 44% e 17%, respectivamente (Kuchenbaecker, JAMA 2017).

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RNA polimerases e inibidores (α-amanitina) · promotor e enhancers · cap 7-mG · splicing (GU–AG, spliceossomo) · splicing alternativo · poliadenilação · aplicações: β-talassemia, nusinersen, vacinas de mRNA

1. A máquina da transcrição

A RNA polimerase lê a fita molde (template) no sentido 3'→5' e sintetiza RNA 5'→3'. Nos eucariotos, a pol II transcreve os genes codificantes de proteína: os fatores gerais montam no promotor (caixa TATA ~25 pb a montante, reconhecida pelo TBP/TFIID; Inr no sítio de início), o TFIID ancora o complexo, o TFIIH desenrola a dupla e fosforila o domínio CTD da pol II — essa fosforilação recruta a maquinaria de processamento. Enhancers atuam a distância e independem de orientação, unidos por alças de DNA.

2. Processamento do pré-mRNA: a ordem importa

• 1) CAP 5': 7-metilguanosina ligada por ponte 5'-5' trifosfato, ainda co-transcricional — protege contra exonucleases, é o sítio de ligação do eIF4E para iniciar a tradução e participa da exportação nuclear.
• 2) SPLICING: remoção dos introns GU...AG pelo spliceossomo (snRNPs U1 no sítio doador 5', U2 no ponto de ramificação com laço lariat, U4/U5/U6 catalisam). Erros aqui causam doenças — ver abaixo.
• 3) PÓLI-A: clivagem 10–30 nt a jusante do sinal AAUAAA e adição de ~200 adenilas pela poli(A) polymerase — estabilidade, exportação e eficiência de tradução.
• O produto maduro: 5'-cap — ORF (AUG...códon de parada) — 3'-poli-A, sem introns.

3. Aplicações clínicas: do splicing doentio às vacinas de mRNA

na centralTranscrição e Processamento de RNA: do Gene ao mRNA Maduro →

propriedades do código (tríplice · degenerado · não ambíguo · quase universal) · wobble · etapas da tradução · antibióticos e toxinas que atuam no ribossomo · código mitocondrial · MELAS/MERRF

1. O código: cada propriedade vale uma questão

• Tríplice e sem vírgulas: 3 nucleotídeos por aminoácido, leitura contínua em moldura (frame) definida pelo AUG — 4³ = 64 combinações para 20 aminoácidos + parada.
• Degenerado (sinônimo): vários códons codificam o mesmo aminoácido — a degenerescência mora sobretudo na 3ª base (wobble), o que blinda contra mutações silenciosas.
• NÃO ambíguo: um dado códon especifica um e apenas um aminoácido — degenerado não é vago.
• Quase universal: o núcleo do código é compartilhado; a mitocôndria de vertebrados é a exceção clássica (UGA = triptofano; AGA/AGG = parada; AUA = metionina).
• História que cai: Nirenberg e Matthaei (1961) traduziram poli-U em sistema livre de célula e obtiveram polifenilalanina — UUU = fenilalanina, o primeiro códon decifrado.

2. Etapas da tradução — eucarioto × procarioto

3. O ribossomo como alvo: antibióticos e toxinas

4. Clínica: quando o defeito está na tradução mitocondrial

Mutações em tRNAs mitocondriais derrubam a tradução das 13 subunidades respiratórias codificadas pelo mtDNA: m.3243A>G no tRNA de leucina → MELAS (encefalopatia mitocondrial, acidose láctica, acidentes vasculares cerebrais isquêmicos semelhantes a AVC); m.8344A>G no tRNA de lisina → MERRF (mioclônus, epilepsia, fibras vermelhas rasgadas). Herança materna, heteroplasmia variável e limiar energético explicam a expressividade variável — o mesmo mecanismo tradução-dependente que as bancas cruzam com genética mitocondrial.

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níveis de regulação · cromatina e epigenética (acetilação · metilação de histonas · CpG) · imprinting genomico (Prader–Willi/Angelman) · fatores de transcrição e operon lac (Jacob–Monod) · microRNAs e miravirsen

Todos os nucleados carregam o mesmo genoma — o que diferencia neurônio de hepatócito é a EXPRESSÃO. O principal ponto de controle é a iniciação da transcrição, mas a regulação acontece em todos os níveis: acessibilidade da cromatina → fatores de transcrição → processamento do RNA → estabilidade/tradução do mRNA (microRNAs) → pós-traducional.

1. Cromatina e epigenética: escrever sem mudar a sequência

O nucleossomo enrola 147 pb de DNA em um octâmero de histonas (H2A, H2B, H3, H4 ×2; H1 trava o linker). Modificações covalentes mudam a compactação: acetilação de histonas (HAT) neutraliza cargas positivas e ABRE a cromatina; desacetilação (HDAC) fecha. Metilação do DNA em ilhas CpG de promotores (DNMT1 manutenção; DNMT3A/B de novo) silencia genes. Epigenética = mudança herdável de expressão SEM mudança de sequência — e é reversível, o que a torna alvo farmacológico.

2. Fatores de transcrição e o operon lac

Fatores de transcrição são proteínas modulares: domínio de ligação ao DNA (dedo de zinco, hélice-volta-hélice, zíper de leucina) + domínio de ativação/recrutamento. O modelo fundador da regulação é o operon lac de E. coli (Jacob e Monod, J Mol Biol 1961 — Nobel 1965): controle NEGATIVO pelo repressor LacI ligado ao operador (a lactose, via alolactose, desliga o repressor) e controle POSITIVO pelo complexo CAP–cAMP, que só se forma com glicose BAIXA. Resultado: o operon liga com lactose presente E glicose ausente.

3. microRNAs: repressão pós-transcricional com tradução clínica

Biogênese: pri-miRNA nuclear → Drosha/DGCR8 corta → pré-miRNA (~70 nt) sai pelo exportina-5 → Dicer gera o duplex de ~22 nt → uma fita entra no complexo RISC (Argonaute). Com complementaridade PARCIAL ao 3'UTR, o miRNA reprime a tradução e acelera a degradação do mRNA alvo; com complementaridade perfeita, corta (lógica siRNA). São mais de 2.000 miRNAs humanos regulando a maioria dos genes de mamíferos (Bartel, Cell 2018) — um único miRNA coordena programas celulares inteiros.

na centralRegulação da Expressão Gênica: da Cromatina aos microRNAs →

tipos de mutação (pontuais · frameshift · expansões de repetições · CNV) · transição × transversão · mutagênios e assinaturas (UV · tabaco · aflatoxina) · teste de Ames · resposta ao dano (p53) · MSI e assinaturas mutacionais no câncer

1. Tipos de mutação: o vocabulário que a prova exige

2. Agentes mutagênicos e suas assinaturas

3. Teste de Ames: triagem rápida de mutagênese

O teste de Ames usa cepas de Salmonella typhimurium auxotróficas para histidina (his⁻): o composto a testar é placado com a bactéria; mutagênicos revertem o alelo (his⁺) e formam colônias em meio sem histidina — o número de revertentes é proporcional à potência mutagênica. Como muitos carcinógenos são PRÓ-mutagênicos que só ativam no fígado, o teste inclui a fração S9 de microssomos hepáticos de rato. É barato e rápido, triando candidatos antes da carcinogênese animal — e a lógica (reversão de auxotrofia) é a parte que a banca cobra.

4. Resposta ao dano e instabilidade no câncer

A resposta ao dano (DDR) é uma cascata de sensores e transdutores: ATM (quebras duplas) e ATR (forquilha travada) ativam CHK2/CHK1 e p53, que para o ciclo em G1/S (via p21), permite o reparo ou dispara a apoptose (BAX) — p53 é o guardião do genoma, mutado em cerca de metade dos cânceres; na linhagem germinativa causa Li-Fraumeni (sarcomas, mama precoce, tumores cerebrais, adrenal na infância). A instabilidade genômica é marca evolutiva do câncer (Negrini, Nat Rev Mol Cell Biol 2010) e se organiza em eixos: instabilidade de NUCLEOTÍDEO (MMR deficiente → MSI), CROMOSSÔMICA (CIN — aneuploidias, perda/ganho de braços; via da maioria dos colorretais esporádicos) e de TELOMERO/estresse replicativo.

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PCR · RT-PCR · qPCR (Ct e MIQE) · Sanger e NGS (exoma · genoma) · fluxo de escolha do teste genético · biomarcadores (BEST) · BRCA · painel de 21 genes (TAILORx) · aplicações: HIV, tuberculose, BCR-ABL1

1. PCR: amplificar para detectar

Cada ciclo tem três passos: desnaturação (94–95 °C), anelamento dos primers (50–65 °C) e extensão pela Taq polimerase (72 °C) — amplificação exponencial 2ⁿ: 30 ciclos geram ~10⁹ cópias do alvo (Saiki, Science 1988). Variantes clínicas: RT-PCR (RNA → cDNA pela transcriptase reversa: carga viral, SARS-CoV-2), qPCR em tempo real (fluorescência a cada ciclo; o Ct — ciclo de limiar — é INVERSAMENTE proporcional ao logaritmo da carga; normas MIQE para publicação, Bustin, Clin Chem 2009), nested (mais sensível, risco de contaminação) e multiplex (vários alvos na mesma reação).

2. As aplicações diagnósticas que caem

3. Sequenciamento: de Sanger ao NGS

Sanger (ddNTP terminadores; Nobel 1980): leitura de ~800–1.000 pb, padrão-ouro para um gene/alvo conhecido — heterozigotos aparecem como picos sobrepostos. O NGS (sequenciamento de próxima geração) lê milhões de fragmentos em paralelo (Metzker, Nat Rev Genet 2010): painéis multigênicos (ex.: câncer hereditário), exoma (~2% do genoma; rendimento diagnóstico de ~25–35% nas doenças raras em pediatria/neurologia) e genoma completo (3,2 Gb, inclui não codificante). O custo por genoma caiu de centenas de milhões de dólares (2001) para algumas centenas a ~1.000 dólares (NHGRI) — a barreira deixou de ser técnica e passou a ser interpretação (variantes VUS e aconselhamento).

4. Biomarcadores moleculares: a taxonomia BEST

Biomarcador é uma característica mensurável que indica um processo biológico normal, patogênico ou resposta terapêutica (Atkinson, Clin Pharmacol Ther 2001; framework FDA-NIH BEST). A diferença que derruba candidato: PROGNÓSTICO prevê o desfecho independentemente do tratamento; PREDITIVO antecipa o BENEFÍCIO DE UM TRATAMENTO ESPECÍFICO.

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estratégias (reposição · edição · RNA-terapias) · vetores (AAV · lentivírus · adenovírus) · CRISPR-Cas9, PAM, base e prime editing · exa-cel/BCL11A · Luxturna · Zolgensma · riscos: off-target, mutagênese insercional, imunogenicidade

1. As quatro estratégias

2. As aprovações que caem

3. Vetores: a escolha define o risco

4. Riscos, barreiras e prognóstico

• Off-target: edições em sítios semelhantes ao alvo — mapeadas por sequenciamento profundo pré-clínico; base/prime editing reduzem (sem quebra dupla).
• Mutagênese insercional: risco do vetor integrante — resolvido parcialmente com lentiviral SIN e ensaios ex vivo.
• Imunogenicidade: anticorpos anti-AAV pré-existentes e resposta T contra a cápsula; o óbito de Gelsinger (adenovírus) permanece o alerta fundador.
• Durabilidade: AAV dura anos em tecidos não divisores; dilui-se em células divisoras — a integração lentiviral resolve, ao custo do risco insercional.
• Acesso: preços de tabela nos EUA na casa de US$ 0,85 milhão (Luxturna) a US$ 2,1–2,2 milhões (Zolgensma; Casgevy) — desafio de custo-efetividade e equidade em sistemas públicos.

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