Replicação do DNA e Mecanismos de Reparo

Cada divisão celular duplica cerca de 6 bilhões de bases e o faz com espantosa precisão: graças à seletividade das polimerases, à revisão 3' para 5' e ao reparo de erros de pareamento, a taxa final de erro cai para aproximadamente 1 base alterada a cada 10^9 nucleotídeos copiados. Quando esse sistema falha, as consequências aparecem em todas as disciplinas: síndrome de Lynch no câncer de colorretal, xeroderma pigmentoso na dermatologia, ataxia telangiectasia na neurologia e mutações de BRCA1 e BRCA2 na mastologia. Além disso, metade da quimioterapia e toda a radioterapia funcionam justamente criando lesões de DNA que as células tumorais não conseguem reparar. Dominar replicação e reparo é, portanto, dominar genética do câncer e farmacologia antineoplásica ao mesmo tempo.

01Modelo semiconservativo: o experimento de Meselson e Stahl

Em 1953 Watson e Crick propuseram a estrutura de dupla hélice e sugeriram, implicitamente, três modelos de replicação: conservativo (a molécula parental permanece intacta e uma filha totalmente nova é sintetizada), semiconservativo (cada molécula filha mantém uma fita parental e uma nova) e dispersivo (fitas parental e nova se entremeiam em segmentos). Em 1958, Meselson e Stahl resolveram a questão com bactérias marcadas isotopicamente, experimento apelidado de o mais belo da biologia.

• Cultivaram Escherichia coli por várias gerações em meio com cloreto de amônio marcado com nitrogênio pesado (15N): todo o DNA das bactérias fica denso.
• Transferiram as bactérias para meio com 14N (nitrogênio leve) e coletaram DNA após uma e duas gerações.
• Submeteram o DNA à ultracentrifugação em gradiente de densidade de cloreto de césio: moléculas de densidades diferentes formam bandas em posições diferentes no tubo.
• Geração zero: uma banda densa (15N/15N). Após uma geração em 14N: uma única banda de densidade intermediária (híbrida 15N/14N), o que já elimina o modelo conservativo, que preveria duas bandas (densa + leve).
• Após duas gerações: duas bandas de igual intensidade, uma híbrida (15N/14N) e uma leve (14N/14N), o que elimina o modelo dispersivo, que preveria apenas uma banda que migraria progressivamente para o leve.
• Conclusão: a replicação é semiconservativa; cada fita parental serve de molde para uma fita nova, por complementaridade de bases.

02Da origem à forquilha: a maquinaria enzimática da replicação

A replicação começa em sequências específicas chamadas origens: em Escherichia coli, uma única origem (oriC); em eucariotos, múltiplas origens por cromossomo, ativadas simultaneamente para completar a duplicação do genoma dentro da fase S. Nas origens, a helicase quebra as pontes de hidrogênio e abre a dupla hélice, criando duas forquilhas de replicação que avançam em sentidos opostos (replicação bidirecional), com as fitas simples expostas estabilizadas por proteínas. Como a dupla hélice se torce, a abertura gera superenrolamento positivo à frente da forquilha, aliviado por topoisomerases. A partir de cada forquilha, as duas fitas novas são sintetizadas obrigatoriamente na direção 5' para 3', o que cria uma fita líder contínua e uma fita tardia descontínua.

03DNA polimerases: as três regras que resolvem qualquer questão

Toda questão de polimerase se resolve com três regras. Primeira: a síntese ocorre apenas na direção 5' para 3', porque o grupo 3'-hidroxila do extremo da cadeia ataca o alfa-fosfato do desoxirribonucleotídeo entrante; é por isso que a fita que corre no sentido da abertura (líder) é contínua e a antiparalela (tardia) precisa ser feita em pedaços. Segunda: as polimerases replicativas têm atividade exonuclease 3' para 5', a leitura de prova que remove imediatamente a base mal pareada do extremo 3', reduzindo o erro em cerca de 100 vezes. Terceira: nenhuma polimerase inicia cadeia de novo, todas precisam de primer com 3'-OH livre, feito de RNA pela primase; a exceção funcional é a telomerase, que carrega seu próprio molde de RNA interno.

• Em bactérias: pol III replica o genoma; pol I remove os primers (exonuclease 5' para 3'), preenche com DNA e participa da excisão de bases; pol II e IV e V participam de reparo e síntese translesão.
• Em eucariotos: pol alfa-primase inicia (sem revisão); pol épsilon replica a fita líder; pol delta replica a fita tardia e preenche; pol gama replica o DNA mitocondrial; pol eta, kappa, iota e zeta são translesão.
• Síntese translesão: polimerases de baixa fidelidade que contornam lesões que bloqueiam as replicativas; a pol eta contorna os dímeros de timina induzidos por UV, e sua perda define a variante do xeroderma pigmentoso.

04Fita tardia, fragmentos de Okazaki e o problema da extremidade telomérica

Na forquilha, a fita que é sintetizada afastando-se da abertura (tardia) precisa recomeçar a cada trecho exposto, gerando os fragmentos de Okazaki: cerca de 1.000 a 2.000 nucleotídeos em bactérias e 100 a 200 em eucariotos. Cada fragmento começa com primer de RNA, que depois é removido (RNase H e endonuclease FEN1 em eucariotos; exonuclease 5' para 3' da pol I em bactérias), o vão é preenchido e a ligase sela o nick. A extremidade 3' da fita tardia, porém, não pode ser completamente preenchida após a remoção do primer terminal: a cada divisão, o cromossomo linear encurta cerca de 50 a 100 pares de bases, o chamado problema do fim da replicação. A solução são os telômeros, tractos de repetições TTAGGG com proteínas shelterin que protegem as pontas de serem reconhecidas como quebras. A telomerase, uma contratranscriptase formada pela proteína TERT e pelo RNA molde TERC, alonga a ponta 3' adicionando repetições que compensam o encurtamento.

A telomerase é ativa em células germinativas, em células-tronco e em linfócitos ativados, e reprimida na maioria das células somáticas, que encurtam seus telômeros até entrar em senescência replicativa, um dos mecanismos antitumorais intrínsecos. Entre 85% e 90% dos cânceres humanos reativam a telomerase para replicar indefinidamente. Síndromes de telômero curto, como a disqueratose congênita (mutações em TERC, TERT ou reguladores), causam anemia aplásica, fibrose pulmonar, displasia ungueal, leucoplasia oral e hiperpigmentação reticular, ligando biologia molecular direto à hematologia.

05Checkpoints do ciclo celular: a resposta ao dano de DNA

Lesões de DNA acionam uma cascata de sinalização que pausa o ciclo, ativa o reparo ou, se o dano é irreparável, induz apoptose. Quebras de dupla fita são reconhecidas pelo complexo sensor MRN (MRE11-RAD50-NBS1), que recruta e ativa a ATM; estresse de replicação e fita simples exposta ativam ATR via ATRIP e RPA. ATM fosforila CHK2 e ATR fosforila CHK1, e ambas convergem para p53: p53 transativa p21 (inibidor de CDK) e BAX/PUMA. Daí os três checkpoints: G1/S impede a entrada em fase S com DNA lesado; intra-S desacelera a síntese; G2/M impede a mitose com replicação incompleta ou cromossomos quebrados.

• p53, o guardião do genoma: na vigência de dano, para o ciclo (via p21), ativa reparo e, se persiste o dano, deflagra apoptose; mutado em cerca de 50% dos cânceres humanos.
• Síndrome de Li-Fraumeni: mutação germinativa de TP53, herança autossômica dominante, sarcomas ósseos e de partes moles, câncer de mama precoce, leucemias, tumores cerebrais e carcinoma adrenocortical na infância.
• Ataxia telangiectasia: mutação de ATM, herança autossômica recessiva; ataxia cerebelar progressiva, telangiectasias oculocutâneas, imunodeficiência com IgA baixa, extrema radiossensibilidade e alto risco de linfomas e leucemias.
• Síndrome de Nijmegen (microcefalia, imunodeficiência, radiossensibilidade): defeito da NBS1 (nibrina), o mesmo complexo sensor MRN.

06Reparo de erros de pareamento (MMR): da MutSL à síndrome de Lynch

O sistema mismatch repair corrige bases mal pareadas e pequenas alças de inserção-eliminação que escapam da revisão da polimerase. Em bactérias, MutS reconhece o erro, MutL orquestra a resposta e MutH corta a fita recém-sintetizada (identificada por estar temporariamente não metilada). Em humanos, o homólogo de MutS é o heterodímero MSH2-MSH6 (MutS alfa, para pareamentos errados e alças de 1 base) ou MSH2-MSH3 (MutS beta, para alças maiores); o homólogo de MutL é MLH1-PMS2 (MutL alfa). Após o reconhecimento, EXO1 degrada o trecho com erro, pol delta ressintetiza e a ligase sela. A falha congênita de um alelo desse sistema causa síndrome de Lynch; a falha de ambos ou a metilação somática do promotor de MLH1 causa instabilidade de microssatélites (MSI) nos tumores.

A síndrome de Lynch (câncer colorretal hereditário não polipósico, HNPCC) é autossômica dominante, com mutação germinativa em MLH1 ou MSH2 na maioria dos casos, seguidas por MSH6, PMS2 e deleções de EPCAM que silenciam MSH2 vizinho. Cumpre-se o modelo de dois eventos: o alelo selvagem remanescente é perdido nas células do epitélio colônico, o MMR falha e mutações acumulam-se em microssatélites de genes de crescimento (TGFBR2, BAX). Clínica: câncer colorretal de cólon direito, precoce (antes dos 50 anos), com mucina e infiltração linfocitária; segundo tumor mais comum é o endométrio, seguidos por ovário, estômago, urotélio, intestino delgado, pâncreas e cérebro; variantes são Turcot (tumor cerebral) e Muir-Torre (carcinomas sebáceos). Critérios de Amsterdam (regra 3-2-1): pelo menos 3 familiares com câncer associado, em 2 gerações, 1 deles antes dos 50 anos. Tumores MSI-high têm melhor prognóstico, pouco benefício de quimioterapia com 5-fluorouracil isolado e resposta excepcional aos inibidores de PD-1 como pembrolizumabe, aprovados justamente para tumores com dMMR/MSI-high independente da origem.

07Nucleotídeo excision repair (NER) e xeroderma pigmentoso

O NER repara lesões que distorcem a dupla hélice, os adutos volumosos: dímeros de pirimidina induzidos por UV (ciclobutano e 6-4 fotoproduto), metabólitos de benzo[a]pireno da fumaça e adutos intrafita de cisplatina. Opera por duas vias que convergem. A via global do genoma (GG-NER) varre todo o DNA com o complexo XPC-RAD23B (auxiliado por DDB2/XPE nos dímeros de timina); a via acoplada à transcrição (TC-NER) é disparada quando a RNA polimerase II trava sobre uma lesão no filamento transcrito, sinalizada pelas proteínas CSA e CSB. A partir daí, TFIIH (helicases XPB e XPD) abre a hélice, XPA-RPA confirmam a lesão, a endonuclease XPF-ERCC1 corta 5' e XPG corta 3', liberando um oligonucleotídeo de cerca de 30 bases, que é ressintetizado por pol delta/épsilon e selado.

Xeroderma pigmentoso é a doença do NER: herança autossômica recessiva por mutações em XP-A a XP-G (via clássica) ou na pol eta (variante, com NER intacto). Os pacientes têm fotossensibilidade extrema, sardas antes dos 2 anos e risco de câncer de pele milhares de vezes maior, com melanoma e carcinomas escamosos antes dos 10 anos de idade em muitos casos; nos grupos XP-A e XP-D pode haver degeneração neurológica progressiva. Nas crianças que não podem reparar dímeros de UV, qualquer exposição solar acumula mutações. Síndrome de Cockayne defeita apenas a TC-NER (CSA/CSB): fotossensibilidade com nanismo caquético, face de pássaro, calcificações basais e retinopatia, mas sem excesso de câncer, porque a via global continua a reparar o restante do genoma; a tricotiodistrofia (XPB/XPD) soma cabelo quebradiço com baixo enxofre.

08Base excision repair (BER): o reparo cotidiano das bases

O BER corrige lesões pequenas que não distorcem a hélice: desaminação espontânea (citosina vira uracilo a cerca de 100 bases por célula ao dia; a 5-metilcitosina vira timina), despurinação (milhares de sítios abásicos por célula ao dia), oxidação (8-oxoguanina, que pareia com adenina e gera transversão G-T) e alquilação. Cada DNA glicosilase reconhece um tipo de base alterada (UNG remove uracilo, OGG1 remove 8-oxoguanina, MUTYH remove a adenina mal pareada com 8-oxoG) e a cliva da fita, criando sítio AP; a endonuclease APE1 corta o backbone; pol beta preenche uma base nova e a ligase III com XRCC1 sela. Aplicação clínica direta: a polipose associada à MUTYH é herança autossômica recessiva com dezenas a centenas de pólipos e câncer colorretal por transversões G-T no gene APC.

09Quebras de dupla fita: recombinação homóloga x NHEJ, BRCA1 e BRCA2

A quebra da dupla fita é a lesão mais letal ao genoma, induzida por radioterapia, radicais livres, agentes bifuncionais como a platina interfilamentos e colapsos de forquilha. Duas vias a reparam, e a escolha depende da fase do ciclo. A recombinação homóloga (HR) opera nas fases S e G2, quando existe a cromátide irmã como molde: as pontas 5' são resecionadas (MRN-CtIP, EXO1, BLM), RPA cobre a fita simples, BRCA2 carrega RAD51, o filamento RAD51 invade a cromátide irmã e copia a informação perdida, com resolução sem erros. A junção de extremidades não homólogas (NHEJ) opera preferencialmente em G0 e G1: o heterodímero Ku70-Ku80 abraça as pontas, recruta a DNA-PKcs e a nuclease Artemis, que aparam as extremidades, e o complexo XRCC4-ligase IV sela a junção, frequentemente com perda ou ganho de poucas bases, sendo mutagênica. O NHEJ é também a maquinaria da recombinação V(D)J dos linfócitos; defeitos causam imunodeficiência combinada grave com radiossensibilidade.

Mutações germinativas de BRCA1 e BRCA2 causam a síndrome hereditária de câncer de mama e ovário, autossômica dominante. O risco acumulado de câncer de mama até os 70-80 anos é de aproximadamente 55 a 72% em portadoras de BRCA1 e 45 a 69% em BRCA2; o risco de câncer de ovário é maior em BRCA1 (cerca de 40%) do que em BRCA2 (cerca de 10 a 20%). BRCA2 também eleva o risco de pâncreas, próstata agressivo e melanoma. Tumores com perda de HR são profundamente sensíveis a sais de platina e, de forma específica, aos inibidores de PARP, por letalidade sintética: a PARP1 detecta e sela quebras de fita simples; o inibidor trava a enzima no DNA (trapping) e as quebras acumuladas colapsam as forquilhas gerando quebras de dupla fita letais apenas nas células sem HR funcional.

10Síndromes de instabilidade genômica: a tabela que fecha a matéria

11Oncofarmacologia: o reparo do DNA como alvo terapêutico

Quimioterápicos e radioterapia exploram o fato de que a célula tumoral divide-se mais e repara menos. A platina forma adutos intrafita (reparados por NER) e ligações cruzadas interfilamentos (reparadas pela via de HR e Fanconi): tumores com NER eficiente, como câncer de cólon, respondem pouco à cisplatina, e níveis altos de ERCC1 predizem resistência. Os análogos de nucleosídeos competem com os precursores naturais e travam a síntese ou incorporam-se ao DNA. Os inibidores de PARP exploram a letalidade sintética nas células BRCA-deficientes. A radioterapia ioniza a água e gera radicais hidroxila que produzem quebras de dupla fita justamente quando a célula tenta dividir-se, e a oxigenação do tecido fixa o dano (por isso tumores hipóxicos são mais radiorexistentes).

12Pontos de prova e pegadinhas clássicas

• Polimerase só sintetiza 5' para 3' e nunca inicia sem primer; a exonuclease 3' para 5' é a leitura de prova. A pol I bacteriana é a única com exonuclease 5' para 3' (remoção de primer).
• A fita líder é contínua; a tardia é descontínua em fragmentos de Okazaki, cada um iniciado por primer de RNA removido depois por RNase H e FEN1 (eucariotos).
• Telomerase é uma contratranscriptase (TERT + RNA molde TERC), ativa em germinativas, células-tronco e na maioria dos cânceres, e deficiente nas síndromes de telômero curto.
• MSH2-MSH6 e MLH1-PMS2 formam MutS alfa e MutL alfa humanos; Lynch é autossômica dominante, cólon direito, endométrio, MSI-high, resposta a anti-PD-1.
• Xeroderma pigmentoso é NER (riscos de câncer de pele multiplicados por milhares); Cockayne é só a via acoplada à transcrição (sem excesso de câncer); a variante do XP é defeito da pol eta.
• BRCA2 carrega RAD51 na recombinação homóloga; a deficiência gera sensibilidade a platina e letalidade sintética com inibidores de PARP, não a resistência.
• Ataxia telangiectasia é ATM (quebra de dupla fita); Li-Fraumeni é TP53; Bloom é BLM; Fanconi é reparo de ligações cruzadas; disqueratose congênita é telomerase/telômero.