Transcrição e Processamento de RNA: do Gene ao mRNA Maduro

A transcrição é o primeiro e mais regulado passo da expressão gênica: a cópia de uma fita de DNA em RNA catalisada por RNA polimerase, na direção 5 para 3, a uma velocidade de dezenas de nucleotídeos por segundo. Nos eucariotos, o produto imediato da RNA polimerase II não é um mRNA funcional, mas um pré-mRNA que precisa de três modificações covalentes — cap 5, splicing e cauda poli-A — para ser exportado e traduzido. Com cerca de 20.000 genes codificadores de proteína gerando mais de 100.000 transcritos distintos, é o processamento do RNA, e não apenas a iniciação da transcrição, que explica a complexidade do proteoma humano. Para a prova, os pontos de maior rendimento são: qual polimerase sintetiza o quê, os inibidores clássicos (alfa-amanitina, rifampicina, actinomicina D), os sinais de splicing GU-AG, o sinal de poliadenilação AAUAAA e as doenças que resultam de erros de processamento.

01Arquitetura do gene eucariótico e as três RNA polimerases

O gene eucariótico codificador é organizado em exons (sequências que permanecem no mRNA maduro) e introns (removidos pelo splicing), ladeado por sequências regulatórias: o promotor core, posicionado em torno do sítio de iniciação (elementos TATA box a montante de 25-30 nucleotídeos, Inr, BRE e DPE, ou ilhas CpG, presentes na maioria dos promotores humanos), e elementos distais — enhancers e silencers — que atuam a milhares de pares de bases de distância, independentes de orientação, através de alças de DNA. Enquanto procariotos têm uma única RNA polimerase (alvo da rifampicina, que se liga à subunidade beta), os eucariotos possuem três polimerases nucleares com repertório próprio e sensibilidade diferente à alfa-amanitina da Amanita phalloides, distinção cobrada há décadas em provas.

02Iniciação da transcrição por RNA polimerase II: promotores e fatores gerais

A RNA polimerase II nunca inicia sozinha: ela é montada no promotor pelos fatores de transcrição gerais (GTFs) TFIIA, TFIIB, TFIID, TFIIE, TFIIF e TFIIH, formando o complexo de pré-iniciação. O TFIID contém a proteína de ligação à TATA (TBP) e os TAFs; o TFIIB define o sítio exato de início; e o TFIIH tem duas atividades cruciais — helicase dependente de ATP que abre a bolha de transcrição e a quinase Cdk7 (do complexo CAK) que fosforila a cauda CTD da polimerase. A CTD (domínio C-terminal) é composta de repetições do heptapeptídeo YSPTSPS (52 repetições no humano) e funciona como uma mesa de montagem: fosforilada na Ser5 marca a iniciação e recruta a maquinaria de capeamento; fosforilada na Ser2 marca o alongamento e recruta fatores de splicing e de poliadenilação — a lição integradora é que transcrição e processamento são acoplados e simultâneos.

• 1. Fatores de transcrição específicos (pioneiros) reconhecem enhancers e promotores e recrutam coativadores com atividade acetiltransferase (p300/CBP), abrindo a cromatina.
• 2. TBP do TFIID liga-se à TATA box ou à região do iniciador; TFIIA e TFIIB estabilizam e selecionam o sítio de início.
• 3. TFIIH abre a dupla hélice (helicase XPB) e fosforila a Ser5 da CTD, liberando a polimerase do promotor (clearance).
• 4. Alongamento produtivo com fosforilação de Ser2; pausas próximas ao promotor são resolvidas pelo fator P-TEFb (Cdk9), alvo de drogas.
• 5. A fosforilação dinâmica da CTD coordena capeamento, splicing e clivagem/poliadenilação do mesmo transcrito.

03Alongamento e terminação: como a polimerase II para

Durante o alongamento, a polimerase II sintetiza RNA a cerca de 10 a 60 nucleotídeos por segundo, com correção por aparagem (cleavage) da prova sob ação da subunidade TFIIS — bem menos exata que a DNA polimerase, o que é tolerado porque o RNA é descartável. A terminação em mamíferos é acoplada à poliadenilação e obedece predominantemente ao modelo torpedo: o transcrito é clivado no sítio de poliadenilação, a polimerase continua sintetizando RNA a jusante que é degradado pela exonuclease Xrn2, que alcança e desprende a polimerase; sinais de pausa ricos em G e a conformação da CTD também participam (modelo alostérico). Como comparação cobrada em prova, as polimerases I e III terminam em sequências terminadoras definidas — a polimerase III para em uma cadeia de timinas (T-tract) logo após o transcrito, dispensando processamento elaborado.

04Processamento I: a capinha 5 (cap 5-prima)

O cap 5 é uma 7-metilguanosina invertida ligada ao primeiro nucleotídeo do mRNA por uma ligação trifosfato 5-5 incomum, instalada de forma cotranscricional quando o transcrito tem apenas 20 a 30 nucleotídeos. A reação ocorre em três passos: remoção de um fosfato pela RNA trifosfatase, transferência do GMP pela guanililtransferase e metilação da guanina pela metiltransferase (cap 0; metilações adicionais das riboses geram cap 1 e cap 2). As funções do cap são um clássico absoluto de prova: protege o mRNA contra exonucleases 5, é reconhecido pelo complexo de ligação do cap (CBC) no núcleo e pelo fator eIF4E no citoplasma para iniciar a tradução, facilita a exportação nuclear e estimula o splicing do primeiro íntron. Nas vacinas de mRNA e em RNAs terapêuticos, o cap 5 é um dos elementos não traduzidos que determinam estabilidade e eficiência traducional junto às UTRs e à cauda poli-A.

05Processamento II: splicing e o spliceossomo

O splicing remove os introns e une os exons por duas reações de transesterificação sucessivas catalisadas pelo spliceossomo, uma máquina de cinco pequenas ribonucleoproteínas nucleares (snRNPs U1, U2, U4, U5 e U6) associadas a mais de 150 proteínas. Os sinais em cis são conservados: sequência doadora 5 iniciando quase sempre em GU, sequência aceitadora 3 terminando em AG, ponto de ramificação (adenosina) localizado 18 a 40 nucleotídeos a montante do aceitador e trato de polipurinas (trato de pirimidinas rico em Y) adjacente. Na montagem, o U1 reconhece a doadora 5, o U2 reconhece o ponto de ramificação (com protrusão da adenosina, em bulge), o trio U4-U5-U6 entra, o U6 substitui o U1 e forma o centro catalítico com o U2: a adenosina do ponto de ramificação ataca a doadora 5 formando o laço (lariat) e liberando o exon 5; na segunda reação, a extremidade 3 do exon livre ataca o aceitador 3, unindo os exons e liberando o intron em laço, que é degradado. Cerca de 1% dos introns humanos usa o spliceossomo menor U12, com sinais AT-AC — mencionado em provas mais refinadas.

Erros de splicing causam pelo menos 15% das doenças genéticas monogênicas e são a base molecular de exemplos cobrados: na beta-talassemia, mutações que criam novos sítios de splicing ou ativam sítios ocultos no gene HBB reduzem a beta-globina; na atrofia muscular espinhal, o gene SMN2 salta o exon 7 produzindo proteína instável (base da terapia com nusinersen, que bloqueia um silenciador intrônico para incluir o exon 7); na distrofia miotônica, o RNA expansivo de CUG sequestra a proteína MBNL e desregula o splicing de dezenas de genes (canal de cloro CLCN1 na miotonia); e mutações nos genes do spliceossomo (PRPF8, SNRNP200) causam retinose pigmentar.

06Splicing alternativo: um gene, muitos produtos

Estimativas de RNA-seq indicam que cerca de 95% dos genes humanos multiexônicos sofrem splicing alternativo, multiplicando o repertório proteico sem aumentar o número de genes. Os padrões clássicos são: salto de exon (exon skipping, o mais comum em mamíferos), sítios doadores ou aceitadores alternativos (mudando o tamanho do exon), exons mutuamente exclusivos, retenção de intron (frequente em células tumorais e no sistema imune) e polyadenilação alternativa. A escolha é regulada por sequências amplificadoras e silenciadoras em exons e introns (ESE, ESS, ISE, ISS) reconhecidas por proteínas SR (como SRSF1, que promove inclusão) e hnRNPs (como hnRNP A1, que promove exclusão) — alterações na fosforilação e expressão dessas proteínas reprogramam o splicing em câncer, gerando isoformas pró-invasão (ex.: CD44 variante, BCL-X longo anti-apoptótico).

07Processamento III: poliadenilação e vigilância do mRNA (NMD)

A cauda poli-A é adicionada em duas etapas: clivagem do pré-mRNA 10 a 30 nucleotídeos a jusante do sinal hexamérico AAUAAA (reconhecido pelo CPSF, com a ajuda do trato rico em GU/U e da CstF), seguida da adição lenta de cerca de 200 a 250 adenilas pela polimerase poli-A (PAP), processo acelerado pela proteína de ligação ao poli-A nuclear (PABPN1). A cauda, revestida por PABP citoplasmático, controla a estabilidade (deadenilação é o primeiro passo de degradação), a eficiência traducional (interação fechada com o cap, eIF4G) e a exportação. Mais da metade dos genes humanos usa sítios de poliadenilação alternativos para encurtar 3UTRs e escapar de microRNAs e elementos desestabilizadores — fenômeno reprogramado em células proliferativas e tumorais.

O sistema de vigilância de nonsenso (nonsense-mediated decay, NMD) degrada mRNAs com códons de parada prematuros e funciona assim: durante o splicing, um complexo de junção de exon (EJC) é depositado cerca de 20-24 nucleotídeos a montante de cada junção; se o ribossomo para em um códon de terminação localizado mais de 50-55 nucleotídeos a montante do último EJC, os fatores de liberação eRF1/eRF3 recrutam a cascata UPF1-UPF2-UPF3 e o mRNA é decapitado e degradado. Essa é a explicação molecular de por que mutações de nonsenso na beta-talassemia geram pouco mRNA (e, quando escapam do NMD, proteína truncada dominante negativa) e a base da estratégia terapêutica de read-through com ataluren na distrofia muscular de Duchenne com códon de parada prematuro.

08Regulação transcricional em nível de cromatina

O acesso da polimerase depende do estado da cromatina: acetilação das lisinas de histonas (por HAT como p300/CBP) neutraliza cargas positivas, relaxa o nucleossomo e é marca de genes ativos — daí o efeito global dos inibidores de desacetilases (vorinostat) em linfomas cutâneos. As marcas de histonas funcionam como linguagem (código de histonas): H3K4me3 marca promotores ativos, H3K27ac marca enhancers ativos, H3K36me3 acompanha a transcrição ao longo do gene, enquanto H3K27me3 (complexo Polycomb) e H3K9me3 (heterocromatina) reprimem. A metilação do DNA em ilhas CpG de promotores recruta proteínas com domínio de ligação a metilcitosina e HDACs, silenciando o gene de forma estável — mecanismo fisiológico da impressão genômica (IGF2/H19) e patológico dos promotores de genes supressores em tumores (ex.: MGMT metilado em glioblastomas, preditivo de resposta à temozolamida).

09Da bancada ao leito: técnicas de RNA e terapias baseadas em RNA

O estudo da transcrição usa técnicas com princípios distintos que aparecem em questões: RT-qPCR quantifica um transcrito específico com alta sensibilidade (RNA retrotranscrito para cDNA e amplificado; análise por delta-delta-Ct com gene de referência); Northern blot separa RNA por tamanho em gel e revela por sonda marcada (clássico para tamanho e splice variants); RNA-seq (sequenciamento massivo do transcriptoma) mapeia e quantifica todos os transcritos, incluindo fusões e splicing anômalo, com versão de célula única (scRNA-seq); hibridização in situ e RNAscope localizam transcritos em cortes de tecido; ensaios de CLIP/RIP identificam as proteínas ligadas ao RNA. Na clínica, a expressão de genes de fusão (BCR-ABL1, PML-RARA, EWSR1-FLI1) detectada por RT-PCR/FISH define diagnóstico e seguimento mínimo residual em leucemias e sarcomas.

10Pontos de prova e pegadinhas clássicas